RNAi生物農(nóng)藥擬在美國首登
2023年9月29日，美國環(huán)境保護署（USEPA）擬建議批準(zhǔn)全球首款基于外源噴灑型的RNA干擾（RNAi）生物農(nóng)藥Ledprona，作為特殊類型的新有效成分，其有效期為3年。目前Ledprona已進入為期15天的公眾評議，公眾評議截止期至2023年10月14日。
（來源：US EPA）
RNAi生物農(nóng)藥的作用機理
Ledprona為美國GreenLight Bioscience公司開發(fā)的RNAi生物農(nóng)藥有效成分，對應(yīng)的產(chǎn)品商品名為“CalanthaTM”。CalanthaTM含有規(guī)格濃度為0.8%雙鏈RNA（double-strand RNA）“Ledprona”作為新型有效成分，用于防治科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Colorado Potato Beetle, CPB; 學(xué)名：Leptinotarsa decemlineata）。與其他RNAi生物農(nóng)藥類似，該產(chǎn)品的作用機理是通過dsRNA激活RNA干擾機制來誘導(dǎo)昆蟲的死亡，其中dsRNA靶向的mRNA序列為科羅拉多馬鈴薯甲蟲蛋白酶亞基Beta type-5（Colorado Potato Beetle Proteasome subunit beta type-5, PSMB5），若含有該dsRNA的殺蟲劑在田間作物葉面噴灑后，CPB幼蟲或成蟲經(jīng)口攝入含此dsRNA的作物，攝入的dsRNA會激活RNA干擾機制，然后引起對應(yīng)mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄水平上進一步影響后續(xù)對PSMB5蛋白的表達下調(diào)。由于PSMB5在甲蟲中屬于關(guān)鍵的管家基因（Housekeeping gene），負(fù)責(zé)調(diào)控CPB中蛋白的準(zhǔn)確折疊，所以PSMB5的表達下調(diào)最終會導(dǎo)致CPB的死亡。
RNAi作用機理：在動物和植物中的基因沉默的差異性
(來源：Retrovirology, 2006, 3: 1-11)
噴灑型RNAi生物農(nóng)藥符合農(nóng)藥定義
構(gòu)成Ledprona的dsRNA并未經(jīng)任何化學(xué)修飾，其與天然存在的相應(yīng)dsRNA本質(zhì)上是一種物質(zhì)，且該dsRNA產(chǎn)生殺蟲活性所誘導(dǎo)的RNA干擾現(xiàn)象在真核生物中普遍存在。
US EPA早在2015年就已批準(zhǔn)登記了首款基于dsRNA的植物嵌入式農(nóng)藥（Plant-incorporated protectant, PIP，即轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藥）DvSnf7（由拜耳/孟山都開發(fā)），該PIP用于防治西方玉米根蟲（western corn rootworm），其原理是通過基因工程手段能夠讓作物體內(nèi)自行生產(chǎn)具有殺蟲活性的dsRNA。但Ledprona與DvSnf7不同，US EPA明確認(rèn)為Ledprona應(yīng)歸類為噴灑型殺蟲制劑的范疇，并應(yīng)按照農(nóng)藥的登記要求來產(chǎn)生數(shù)據(jù)資料并進行評估。
RNAi生物農(nóng)藥的安全性評估要點與難點
在明確RNAi生物農(nóng)藥的農(nóng)藥定義后，GreenLight與US EPA商議后確定以美國生物化學(xué)農(nóng)藥的數(shù)據(jù)要求為基礎(chǔ)，再在此基礎(chǔ)上根據(jù)RNAi生物農(nóng)藥的特點來調(diào)整Ledprona登記所需的數(shù)據(jù)要求。
健康毒理
在健康毒理方面，由于已有眾多的研究表明未經(jīng)化學(xué)修飾的dsRNA不易穿透生物屏障（如皮膚、腸道等），且dsRNA在體內(nèi)易降解，因此dsRNA不太可能被人體吸收并產(chǎn)生系統(tǒng)毒性，因此US EPA同意GreenLight豁免了亞急/亞慢、生殖發(fā)育、致癌性、遺傳毒性等絕大多數(shù)健康毒理試驗資料，而在健康毒理方面數(shù)據(jù)資料的主要構(gòu)成為急性6項毒性試驗，主要目的是用以確定有效成分和制劑產(chǎn)品的危害分類。其余的試驗資料均為非常規(guī)資料或公開來源的文獻資料，這些目的是進一步驗證dsRNA（1）不易透過生物屏障、（2）易在人體內(nèi)降解、（3）不易在人體內(nèi)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（基于生物信息學(xué)分析）以及（4）不易產(chǎn)生免疫原性注。
生態(tài)毒理
在生態(tài)毒理方面，由于Ledprona靶向的為節(jié)肢動物科羅拉多馬鈴薯甲蟲，因此US EPA同意GreenLight將生態(tài)毒理的評估重點放在對節(jié)肢動物以及類似的環(huán)節(jié)動物（如蚯蚓）。由于RNAi生物農(nóng)藥具有防治譜窄的特點，整體對這些動物的生態(tài)毒理評估分為非特異性毒性和特異性毒性兩個方面。
在非特異性毒性方面，主要的作用機理是由于外源dsRNA在這些生物體內(nèi)過載或引起免疫毒性所引起的，對Ledprona非特異性毒性的評估方面主要采用了美國農(nóng)藥法規(guī)中常規(guī)的模式動物。
在特異性毒性方面，由于RNAi生物農(nóng)藥防治譜窄，主要需要明確Ledprona對所防治的科羅拉多馬鈴薯甲蟲的近緣種是否會產(chǎn)生顯著的毒性效應(yīng)，GreenLight首先采用了生物信息學(xué)的技術(shù)進行對靶向的基因進行序列匹配，然后再根據(jù)序列的相似程度對能獲取開展試驗的甲蟲進一步驗證了Ledprona對它們的生物活性。
除此之外，由于美國《瀕危物種保護法》的需要，GreenLight也根據(jù)US EPA的要求對使用地區(qū)所列入的瀕危物種的潛在危害進行了充分評估。
環(huán)境歸趨
GreenLight也開展了兩項非同位素標(biāo)記的環(huán)境歸趨試驗，根據(jù)此項數(shù)據(jù)并結(jié)合了公開來源的文獻資料，綜合表明Ledprona這一dsRNA有效成分在環(huán)境介質(zhì)中的半衰期較低且易降解為低風(fēng)險物質(zhì)。在這些試驗中，為了對環(huán)境介質(zhì)中的有效成分進行準(zhǔn)確的檢測，也采用了新型的核酸檢測方法。
風(fēng)險評估
最后，基于已有的健康毒理和生態(tài)毒理，US EPA通過暴露評估和風(fēng)險評估確認(rèn)了Ledprona膳食風(fēng)險、飲用水暴露風(fēng)險、非職業(yè)或居民健康風(fēng)險、累積效應(yīng)風(fēng)險、人群風(fēng)險和環(huán)境風(fēng)險均可接受。Ledprona對施藥人員也不存在相應(yīng)風(fēng)險，但建議佩戴相應(yīng)的個人防護措施（PPE）。除此之外，由于毒性和暴露量均較低，因此可以豁免對Ledprona的殘留限量要求。
RNAi生物農(nóng)藥是“十四五”期間的優(yōu)先發(fā)展品種，中國亟待商業(yè)化
作為一種安全、綠色、高效且易降解的新型生物農(nóng)藥，RNAi生物農(nóng)藥目前已列入《“十四五”全國農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》，并確定為優(yōu)先發(fā)展的農(nóng)藥品種。作為一種跨時代的技術(shù)，采用RNAi技術(shù)的這一生物農(nóng)藥防治譜極窄、研發(fā)周期較快，符合綠色農(nóng)藥的定義。RNAi生物農(nóng)藥將大大增強我國病害防治的手段，為保障糧食安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、生態(tài)環(huán)境安全發(fā)揮重要作用。
現(xiàn)階段，我國已有多家企業(yè)同步跟進RNAi生物農(nóng)藥的研發(fā)，在病蟲害靶標(biāo)開發(fā)與機理研究、大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)（如合成生物學(xué)技術(shù)）、遞送系統(tǒng)（如納米技術(shù)）等均有重大進展，對于RNAi生物農(nóng)藥的發(fā)展亟需進一步的政策引導(dǎo)來推進中國的商業(yè)化。
RNAi農(nóng)藥的生產(chǎn)與應(yīng)用
(來源: Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9: 753790.)
注：作為外源生物大分子如蛋白、核酸等，若通過生物屏障進入人體內(nèi)易產(chǎn)生免疫原性，因此生物大分子的免疫毒性是醫(yī)藥非臨床毒理研究中關(guān)注的重點。但不同于生物醫(yī)藥大分子，較為充分的證據(jù)表明未經(jīng)修飾和未利用有效遞送系統(tǒng)的生物大分子（如RNAi生物農(nóng)藥）不太可能進入人體內(nèi)，因此對人體產(chǎn)生免疫毒性的可能性較低。對此，GreenLight采用了工廠調(diào)查的方式來研究RNAi生物農(nóng)藥生產(chǎn)工人是否由于暴露潛在的dsRNA而產(chǎn)生超敏反應(yīng)，間接的來支持RNAi生物農(nóng)藥不易產(chǎn)生免疫毒性。